環(huán)狀RNA（circRNA）分子是一類不具有5'末端帽子和3'末端poly(A)尾巴、并以共價(jià)鍵形成封閉環(huán)形結(jié)構(gòu)的RNA分子。與mRNA相比，環(huán)狀RNA具有在生物體內(nèi)高穩(wěn)定性、低免疫原性等優(yōu)勢(shì)，可廣泛應(yīng)用在癌癥、再生醫(yī)學(xué)、蛋白質(zhì)替代、傳染病和自身免疫疾病等多個(gè)領(lǐng)域。
與線性RNA相比，環(huán)狀RNA是一種閉環(huán)結(jié)構(gòu)，不需要帽子結(jié)構(gòu)或polyA尾。由于沒有游離末端，環(huán)狀RNA能夠抵抗RNA外切酶的作用，在細(xì)胞內(nèi)更加穩(wěn)定。
| mRNA | 環(huán)化RNA | |
| 功能 | ||
| 標(biāo)準(zhǔn)真核mRNA結(jié)構(gòu)可進(jìn)行短時(shí)間蛋白表達(dá) | 可編碼表達(dá)蛋白 不編碼起調(diào)節(jié)作用 | |
| 表達(dá)機(jī)制 | ||
| 5’帽子結(jié)構(gòu)+Kozak翻譯起始位點(diǎn) | IRES | |
| 誘導(dǎo)/靶向能力 | ||
| 無(wú) | 有可能，依賴于不同的IRES序列 | |
| 所需工具酶 | ||
| 加帽酶或帽子類似物 | 核酶，去除線性RNA的酶（如RNaseR） | |
| 所需其他序列 | ||
| 5’-UTR，3’-UTR，PolyA尾 | 核酶序列 | |
| 胞內(nèi)穩(wěn)定性 | ||
| 低（一周內(nèi)），依賴加帽效率和長(zhǎng)polyA | 高（兩周左右），無(wú)需帽子和polyA結(jié)構(gòu) | |
| 編碼序列限制 | ||
| 長(zhǎng)，取決于體外轉(zhuǎn)錄酶的上限 | 隨長(zhǎng)度增加成環(huán)效率下降 | |
| 產(chǎn)量 | ||
| 體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)量高 | 體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)量高，但成環(huán)底物濃度受限，成環(huán)效率低 | |
| 成本 | ||
| 中等 | 取決于制備方法 | |
| 表達(dá)強(qiáng)度 | ||
| 瞬時(shí)表達(dá)強(qiáng)度高，下降速度快 | 瞬時(shí)表達(dá)強(qiáng)度相對(duì)弱一些，但持續(xù)性好 | |
| 免疫活性 | ||
| 高 | 低 | |
| 應(yīng)用場(chǎng)景 | ||
| 需快速表達(dá)大量蛋白的應(yīng)用 | 需在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定存在時(shí)間更長(zhǎng)的應(yīng)用 |
宜明生物可提供多種制備circRNA的策略方案，分別基于PIE（內(nèi)含子-外顯子剪接）的環(huán)化策略和基于細(xì)胞內(nèi)自環(huán)化的的策略：
PIE環(huán)化策略：PIE（內(nèi)含子-外顯子）環(huán)化策略是一種體外合成circRNA的常用體外環(huán)化方法。該方法通過設(shè)計(jì)特定的線性RNA前體，利用內(nèi)含子與外顯子的自剪接作用，在體外條件下實(shí)現(xiàn)RNA的環(huán)化。
體內(nèi)自環(huán)化RNA：宜明自主研發(fā)的通過體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的線性但可在細(xì)胞內(nèi)自動(dòng)環(huán)化的RNA（acRNA），其5'端帶有羥基，3'端帶有由核酶或脫氧核酶自我切割形成的2,3-環(huán)磷酸鹽末端。在轉(zhuǎn)染/遞送到細(xì)胞后，acRNA可通過人類tRNA剪接機(jī)制自動(dòng)被細(xì)胞內(nèi)源性連接酶環(huán)化。
以上兩種環(huán)化RNA均在內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（IRES）元件的驅(qū)動(dòng)下表達(dá)編碼的蛋白質(zhì)。
| PIE體外環(huán)化RNA | 宜明生物的acRNA | |
| 簡(jiǎn)介 | ||
| 體外轉(zhuǎn)錄中和轉(zhuǎn)錄后內(nèi)含子核酶剪接成環(huán) | 進(jìn)入細(xì)胞后通過內(nèi)源性連接酶催化完成環(huán)化 | |
| 表達(dá)機(jī)制 | ||
| IRES | IRES | |
| 誘導(dǎo)/靶向能力 | ||
| 有可能，依賴于IRES序列 | 有可能，依賴于IRES序列和自環(huán)化接頭元件 | |
| 所需工具酶 | ||
| RNaseR | 無(wú)需RNaseR | |
| 胞內(nèi)穩(wěn)定性 | ||
| 高，無(wú)需帽子和polyA結(jié)構(gòu) | 細(xì)胞內(nèi)成環(huán)后高，無(wú)需增加額外加帽和加尾工藝 | |
| 編碼序列限制 | ||
| 隨長(zhǎng)度增加成環(huán)效率大幅下降，通常在10K以內(nèi) | 隨長(zhǎng)度增加成環(huán)效率下降，通常在10K以內(nèi) | |
| 產(chǎn)量 | ||
| 體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)量高，但成環(huán)底物濃度受限，成環(huán)效率低，副產(chǎn)物不易去除 | 體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)量高，自環(huán)化最終效率取決于細(xì)胞類型，有較多的可篩選性和針對(duì)性優(yōu)化的可能性。 | |
| 成本 | ||
| 高 | 低 | |
| 表達(dá)強(qiáng)度 | ||
| 瞬時(shí)表達(dá)較強(qiáng)，有可能達(dá)到類似mRNA水平，持續(xù)性好 | 瞬時(shí)表達(dá)較mRNA弱，持續(xù)性好 | |
| 免疫原性 | ||
| 低，但可能殘留人工接頭序列 | 低，接頭為人源化序列，理論上更安全 |
