CDMO服務
GMP級生產制備平臺，先進治療藥品走向世界和商業化的橋梁
簡述AAV生產工藝下游純化的挑戰
發布時間：2024.08.05
經過多年的曲折發展，基因療法已經在遺傳性疾病、傳染病甚至常見病等眾多疾病領域中展現出令人鼓舞的潛力。基因治療就是將“好”基因植入病毒載體，再遞送至宿主細胞，通過修復或取代“壞”的基因，來治療由基因缺陷或者突變導致的疾病。目前基因治療領域常用的病毒載體有腺病毒、慢病毒、腺相關病毒（AAV）以及逆轉錄病毒等，其中AAV因其免疫原性極低、安全性高、宿主細胞范圍廣、擴散能力強、表達穩定以及特異性強等優勢脫穎而出。
表一：截至2022年12月， FDA已批準三種AAV產品上市，EMA已批準5種AAV產品上市/有條件上市
盡管AAV基因治療藥物已顯示出巨大的前景，但是AAV的工業化生產和供應鏈仍是行業發展的主要痛點之一。其中AAV載體純化工藝的種種問題，如空衣殼的去除等，都使得AAV的生產成本與復雜程度大幅度增加。本文將簡要討論AAV生產工藝下游純化工藝的挑戰。
AAV病毒載體的生產流程分為上游病毒包裝和下游病毒純化。上游目的是完成AAV在細胞中的包裝生產，下游目的是將上游加工生產的病毒載體從各種雜質中分離出來，使得最終產品符合質量標準的要求，并能應用于臨床。下游的純化工藝除了提供高純度產品，還需要具有可放大性，可用于大規模生產，能滿足較大規模臨床試驗以及后期商業化的需要。
圖一：AAV的生產流程概述（源自DOI:https://doi.org/10.1016/j.omtm.2021.03.016）
AAV生產過程中產生的雜質大致有兩類。一類源于生產工藝中的原材料和組分，包括細胞底物、細胞培養基以及輔助組分（如病毒和質粒DNA）等，如表一所示。另一類與AAV產品自身性質有關的雜質，如空衣殼，后面將詳細介紹。
1、生產相關雜質
宿主細胞DNA殘留的擔憂是基于致癌風險理論，特別是生產細胞系所包含的致癌序列，比如最常見腺病毒基因E1A和E1B（HEK293, PerC.6 和CAP 細胞系），人乳頭瘤病毒E6和E7基因（HeLa細胞系)等。當使用致癌細胞系生產AAV時，下游純化須盡可能減少殘留DNA。工業上一般使用核酸酶分解殘留DNA，普遍認為小于200 bp的DNA片段可顯著降低致癌風險。
宿主細胞蛋白殘留與免疫原性、炎癥或過敏性休克有關。盡管與非人類的生產原料相比（非人類細胞系如BHK21或昆蟲細胞，以及輔助病毒如HSV、腺病毒、桿狀病毒），人類細胞免疫原性比較弱。但是考慮到AAV較大的治療劑量，宿主細胞蛋白以及病毒蛋白相關的風險就不容忽視，因此在下游生產過程中必須盡可能減少蛋白殘留。
另外在上游過程中可能會引入其他雜質，比如培養基所含的胎牛血清（BSA）、分解DNA的核酸酶、破壞細胞的洗滌劑，以及可能使用的輔助病毒（如HSV、腺病毒或桿狀病毒)等，因此對上游的生產原料須加以控制，盡可能避免有毒性的原料。
產品相關性雜質是指在生產或存儲過程中形成產品的分子變體，包括生物合成過程的中間產物、包裝內容物不正確的病毒顆粒（空衣殼/部分衣殼，包裝殘留質粒或宿主細胞 DNA 的類 AAV 病毒顆粒），以及降解的、氧化或是聚集的載體。這類雜質并無治療效果，而且存在安全隱患。表2列出了與AAV載體產品相關雜質，包括表征方法及其潛在毒性。
表二：與AAV載體產品相關的雜質
（源自：https://doi:10.3390/biomedicines2010080）
目前三種AAV載體的生產體系（三質粒瞬轉體系、桿狀病毒表達載體體系以及包裝細胞體系） 中都會出現三種衣殼：完整衣殼（full capsid）、部分衣殼（partial capsid），和空衣殼（empty capsid）。其中完整衣殼包含正確的DNA序列，是人們所期待的產品；部分衣殼和空衣殼包含部分不包含目的基因，屬于生產中的雜質，約占細胞生產的總AAV顆粒的50%-90%。
空衣殼/部分衣殼有如下幾種危害：1), 影響產品的純度，2), 增加最終產品的免疫原性，3), 與完整衣殼競爭感染細胞上的載體結合受體，抑制完整衣殼的轉導，4),增加總體病毒載量。部分衣殼與空衣殼地存在嚴重地影響了AAV產品的安全性和有效性，因此監管機構強烈建議在整個生產過程中監控空/完整衣殼比（空殼率）。
圖二 ：AAV制備過程中所產生的病毒顆粒類型
（源自：https://doi.org/10.1016/j.omtm.2021.02.010）
在AAV載體制備中減少空衣殼一般兩種方法：一是優化上游載體生成條件，提高包裝效率，減少空衣殼的比例；二是優化下游純化工藝，有效地去除空衣殼。
氯化銫(CsCl)/碘克沙醇密度梯度離心大概是最古老的最傳統的AAV純化技術了。這種技術適用于所有血清型且分辨率高，但是因生產工藝很難放大，低通量等缺點阻礙了其在工業中的應用。繼密度梯度離心之后，色譜法不斷發展，并逐漸成為一種成熟的、主流的方法。色譜法通過載體的凈電荷、疏水性、對配體的親和性、大小以及其他性質來分離并純化載體。這類技術有諸多的優點：更具可擴展性和成本效益，可多次重復使用，可并行運行或串聯運行，還可有效去除非定植劑，這是開發后期的一個關鍵方面。本文重點介紹色譜法中的親和層析以及離子交換層析。
1、親和層析（Affinity chromatography，AC）
AAV下游純化工藝中最常見的第一步是使用親和層析法從細胞裂解物中捕獲衣殼。
圖三：親和層析AAV的純化，通過AAV與填料的基質上偶聯的抗體或納米體地特異性結合來實現
（源自：https://doi.org/10.1016/j.omtm.2020.10.001)
最早一代的親和層析是肝素親和層析（Heparin affinity chromatography）。缺點在于結合背景高、動物源性（駱駝科動物衍生的配體），并且只限于某些AAV血清型（主要用于AAV2）。硫酸化纖維素，CellufineTM sulphated cellulose，是肝素樹脂的替代材料，兩者親和性相似。
AVB Sepharose High Performance是近年來親和層析類的明星產品，可以純化多種AAV血清型，AAV變種和人工合成的衣殼，具有強大的載體結合能力、可接受的濃度和較高回收率，已經在商業化生產中廣泛使用。
AVB與AAV的親和力因血清型而異，例如AVB與AAV3的親和力很強，但是與AAV8和AAV9的親和力就很弱。差異的原因在于AAV的衣殼可變區是否存在一個序列為SPAKFA的AVB結合表位。研究人員將（與AVB結合力弱的）AAV8、rh.64R1, AAV9、 AAV-DJ或AAV-DJ/8等相應位置的序列替換為SPAKFA后，就極大地提高了這些血清型與AVB樹脂的結合，而且不影響效力。
圖四：AVB結合表位 “SPAKFA”
（源自：https://doi.org/10.1016/j.omtm.2020.10.001.)
除了AVB親和柱，POROS CaptureSelect Affinity 樹脂也受到了越來越多的關注。這種樹脂不僅具有強大的AAV顆粒結合能力(每毫升樹脂結合約1014 vg)，還可以用于AAV8和AAV9的純化，且回收率較高（AAV8～80%，AAV9～73%）。POROS樹脂純化效率很高，一次純化即可有效地減少雜質；與AKTA設備相結合后可用于大規模AAV的純化。
有趣的是，POROS樹脂并不像ABV樹脂那樣憑“特定的序列”與AAV結合，比如AAVrh8R 與AAV9更相似，但是只能用POROS AAV8樹脂純化；而AAV-DJ與AAV8在很大程度上是同源的，但AAV-DJ卻不能用POROS AAV8樹脂純化。因此在使用POROS系統純化某一特定AAV時，必須進行測試。
POROS? CaptureSelect?系統又開發出AAVX 親和樹脂。POROS AAVX可用于廣泛的血清型，包括 AAV1-8、AAVrh10以及其他一些合成的血清型。
離子交換層析 (IEC) 是一種簡單、通用且經濟高效的技術，已成為許多載體純化的關鍵步驟。IEC分為陰離子/陽離子交換柱，其中AEC（Anion-exchange chromatography）適用于AAV純化，是大規模AAV生產中去除空衣殼的主要手段。
AAV衣殼亞種之間因表面電荷的差異導致不同的的等電點。空衣殼PI在6.3左右，包裝了完整基因組DNA后的病毒顆粒PI大致為5.9。AAV與基質之間的靜電相互作用正是取決于衣殼的等電點(pI)和緩沖液的pH值。基于這一原理在正電荷固定相上進行樣品的分離純化，去除雜質（如空衣殼和部分衣殼），并有效地回收目的載體。
盡管AEC理論上可以用于所有AAV血清型中的空衣殼的分離去除，但事實上，還是要就不同的血清型對樹脂以及純化條件進行優化。另外任何影響載體電荷的因素，如血清型、載體設計或轉基因插入的長度，都可能需要重新優化純化條件。
毫無疑問，AAV生產下游純化至關重要，但如果在下游純化階段盲目追求高純度，往往會造成產量的損失。宜明生物董事長兼首席技術官孫秀蓮博士解釋道：“下游純化環節并非孤立存在，上游生產細胞系的選擇、生產流程的設計、生物反應器性能與操作、生產原料的選擇與把控，都很大程度影響下游純化的效率。我們需要在產量與質量的矛盾中找到解決方案。”
圖五：宜明生物的生物反應器（部分）左上：WAVE25/50，右上：200L一次性生物反應器細胞培養；左下，500L一次性生物反應器細胞培養；右下：2000L一次性生物反應器細胞培養
以宜明生物Ubri-AdvancedTMGMP級別AAV生產平臺為例：
在上游生產階段，宜明生物自主馴化了用于AAV病毒生產的293XS細胞株（該細胞株已獲得國家知識產權局頒發的發明專利證書）。293XS培養密度可達1E7 cells/ml，可實現50L-200L-500L-2000L規模細胞培養 ，AAV產率可超過1E14VG/L。高產量可以減輕下游純化階段的壓力（見圖五）。
經過對載體以及轉染體系的優化，提高了AAV包裝效率，從而減輕在AEC步驟去處空衣殼的負擔（見圖六）。孫博士說：“這種較低的空衣殼負載，疊加對AEC技術空間的不斷開發，使平臺實現更高的可擴展性和產品一致性。”
該平臺無血清、無動物源性生產原料、無抗生素、無輔助病毒等，減少了外源性雜質的引入，緩解了下游純化的壓力。
可擴展的兩步法純化流程，可用于多種血清型的純化，包括rAAV2/2、rAAV2/5、rAAV2/8、rAAV2/9。在兩步法純化后實心率高達85%，空殼率則低至8%。部分衣殼低至6%（見圖六）。
圖六： 載體以及轉染體系優化前后AAV空殼率的比較（200 L）。圖A和B：經第一步親和層析捕獲后，AAV空殼率由優化前的74%降至56%；圖C和C：經第二步AEC純化后，AAV實心率為：85%；空殼率為8%；部分衣殼為6%。（數據來源：宜明生物）
宜明生物董事長兼CTO孫秀蓮博士說：
宜明生物Ubri-AdvancedTMGMP AAV生產平臺非常穩健，目前已經成功完成約30批次的GMP AAV生產，2022年共有三款宜明生物提供全程CDMO服務的AAV基因藥物IND申請快速獲批*。我們的Ubri-AdvancedTMGMP AAV生產平臺可以為CGT新藥企業提供更高滴度、高純度以及高度一致性的合規的AAV產品，并通過不斷地技術創新，降低新藥成本，讓新藥、好藥惠及盡早更多患者。
*：與宜明生物合作的四款獲批NMPA IND的分別是天澤云泰的“VGR-R01”和“VGB-R04 ”、朗昇生物的“LX101”以及微知卓的生物人工肝產品——血漿生物凈化柱，其中前三款是AAV基因藥物。
參考資料：
1.https://doi.org/10.1002/biot.202000025
2.https://doi.org/10.18609/cgti.2018.016
3.https://doi:10.3390/biomedicines2010080
4.https://doi.org/10.1016/j.omtm.2021.02.010
5.https://DOI: 10.18609/cgti.2019.110
6.https://DOI 10.1007/s40259-01702345
7.https://doi.org/10.1016/j.omtm.2020.10.001
8.https://doi.org/10.1038/s41467-021-21935-5
宜明生物：https://www.ymbiologics.com/
