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RNA藥物時代來臨，環狀RNA能否后來者居上？
發布時間：2024.07.31
簡述環狀RNA的特征與應用前景（一）
2019年冠狀病毒大流行極大地推動了mRNA疫苗領域的發展和進步，人們不僅注意到mRNA技術在未來疫苗開發領域的顛覆性潛力，同時也引發了對RNA療法用于治療其他傳染病、腫瘤等疾病的熱情。但是mRNA的不穩定性和免疫原性阻礙了其廣泛應用。
與線性RNA相比，環狀RNA（circRNA）缺乏5′帽和poly(A）尾，是一種獨特的共價封閉的單鏈RNA分子，對RNA酶抑制劑（rnasin inhibitor, RNAse R）具有高度抗性，可穩定存在于細胞或組織中。另外circRNA具有物種特異性，在不同的組織和細胞中具有特異性的表達譜。因此以上諸多優勢使circRNA成為生物醫藥領域炙手可熱的“頂流”分子。到目前為止，人們已經嘗試應用合成的circRNAs替代治療性蛋白質、多肽以及疫苗，還將其用作生物傳感器。
我們將陸續就circRNA的特征、應用前景，以及工業生產等多面進行簡單的介紹。
circRNA的特征
1、穩定性
與線性RNA相比，circRNA的主要優勢在于其環形結構增加了穩定性。細胞內大多數線性mRNA的降解主要依賴于脫腺苷酸的降解方式（圖1）。線性mRNA 的 3'-端通常帶有 poly(A)尾， 脫腺苷酸化作用是大多數 mRNA 進行降解的第一步， 由多種脫腺苷酸化酶催化 。脫腺苷酸化后的 mRNA 可脫去 5' 端帽子結構，再由 5' 端到 3' 端進行降解。circRNA缺少5’和3’末端，因此與線性mRNA相比，具有外核酶抗性和更高的體內穩定性。
圖1｜環狀rna和線性mrna的比較。A) mRNA包含一個5 ' -cap和3 ' -poly (A) 尾。它可以通過帽依賴翻譯進行翻譯。大多數mRNA被5 '和/或3 '端外切酶降解。B) CircRNA缺少5 '和3 '端，可以抵抗外切酶的降解，并且可以以帽獨立的方式翻譯。（Doi.org/10.1093/jmcb/mjad031）
雖然circRNA不能通過經典的RNA降解途徑降解，但內切酶可以使其線性化并導致降解。而且circRNA的序列、結構的復雜性，修飾以及環境的影響都會影響其衰變機制，見圖二。
圖2｜已知的circRNA的降解機制舉例。(a)細胞質circRNA通過識別序列的降解方式。上圖:miRNA引導的circRNA降解。下圖:m6A介導的circRNA降解。(b)細胞質circRNA通過識別結構復雜性的降解方式。左圖:PKR識別dsRNA并激活RNaseL介導的circRNA降解。右圖:RNA結合蛋白UPF1及其相關蛋白G3BP1介導高度結構化circRNA的降解。(c)一旦有缺口，典型通路會降解線性化的circRNA。（Doi.org/10.1016/j.addr.2023.114826）
盡管，除了這些途徑外，circRNA降解的整體機制和調控仍未被全面表征，但circRNA更好的穩定性使其能在更長的時間內發揮作用。
表1｜circRNA與基于病毒載體、線性RNA、DNA的治療相比，其免疫原性更低，更安全（Doi.org/10.1093/jmcb/mjad031）
2、非規范翻譯啟動機制
在真核生物中，線性mRNAs采用5 '帽依賴的翻譯方式（圖1）。這一翻譯啟動機制所需起始因子和步驟數量多，需要消耗大量能量。因此，在細胞應激等的不利條件下，這一規范翻譯機制被“關閉”以確保細胞在應激反應中存活。在帽依賴性翻譯失活過程中，細胞則依賴非規范機制來產生生存所需的關鍵蛋白。
2017年，人們發現缺乏5 '帽結構的circRNA采用5 '帽獨立的翻譯機制，也可以編碼蛋白。該機制或依賴于IRES，或依賴于m6A RNA修飾，其中IRESs是最具代表性的帽獨立翻譯起始機制（圖1、圖2）。5’UTR元件形成二級和三級結構，或在IRES反式作用因子(IRES transacting factors ，ITAFs)的幫助下直接招募核糖體亞基，從而繞過了帽識別和eIF4F復合物的需要。
簡言之，circRNA在病毒感染或疾病相關應激中仍然可以編碼蛋白，因此，circRNA比采用帽依賴的線性mRNA療法更具有潛在優勢。
圖2｜左：帽依賴的翻譯起始。eIF4F識別mRNA的5’帽結構，招募43S預起始復合物，隨后在AUG起始密碼子上進行40S和60S核糖體亞基組裝。右:IRES介導的帽獨立翻譯起始。IRES直接招募40S核糖體亞基來啟動80S核糖體在近端起始密碼子的組裝，而不需要規范的起始因子或5’帽。（Doi.org/10.1016/j.addr.2023.114826）
3、蛋白表達
◆ 滾動圈擴增/翻譯
翻譯起始是蛋白表達的限速步驟 (見圖2)。對于線性mRNA來說，核糖體必須反復與RNA模板結合以持續產生編碼的蛋白質。然而，circRNA的結構允許單個起始事件通過滾動圈擴增/翻譯（rolling circle amplification/translation，RCA/RCT) 重復翻譯相同序列。如果從閱讀框中去除所有終止密碼子，就可能生成無限開放閱讀框(ORF)。有人構建了一種含有無限閱讀框的 circRNA，發現其能模擬 RCA 在大腸桿菌內進行翻譯， 且產物分子量約是其同源線性 mRNA 的 100 倍。重要的是，該產物將是一個大的，串聯的產物，可以使用間隔的裂解位點將其分離成不同的單位。
◆ 多順反子表達
真核生物中常見的是單順反子表達機制，即“一基因一多肽”。而原核基因組、病毒基因組和線粒體DNA中多是多順反子表達，即一個mRNA分子可以編碼多個蛋白分子。如果在circRNA導入多個IRES-ORFs，有可能達到接近化學計量的多順反子表達，因為所有編碼的蛋白都具有相同的翻譯起始機制。circRNA的多順反子表達可能對多組分蛋白的純化有益，并有可能控制蛋白質復合物組分的比例。
4、免疫原性
雖然工程化circRNAs的免疫原性一直存在爭議（后續文章將詳細討論），但肯定的是，circRNA比mRNA具有更低的免疫原性。
線性RNA通過病原體識別受體刺激先天免疫系統，引發干擾素翻譯并抑制線性RNA的治療作用；免疫刺激還可引發針對編碼產物不必要的免疫反應，從而抑制其功效。修飾的mRNA(如N1--甲基偽尿嘧啶)可以幫助RNA逃避免疫傳感器，如RIG-I和toll樣受體(TLRs)，從而使mRNA藥物成為可能。因此獲得高純度或修飾是限制免疫原性的關鍵，有助于免于免疫刺激，可以更好地發揮RNA藥物的療效。
較之線性RNA，“免疫沉默”的 circRNA可以更有效地表達蛋白質，而不會產生抑制性干擾素反應。此外，先天免疫系統激活的降低限制了樹突狀細胞的激活和成熟，從而有助于逃避對所編碼的治療性蛋白的免疫。純化的circRNA也不具備三磷酸基序以及ssRNA或dsRNA片段。
Ref：
1.Clinical delivery of circular RNA: Lessons learned from RNA drug development ，Doi.org/10.1016/j.addr.2023.114826
2.Differences in the immunogenicity of engineered circular RNAs ，Doi：10.1093/jmcb/mjad002
3.RNA-based therapeutics: an overview and prospectus， Doi.org/10.1038/s41419-022-05075-2
4.Biological functions and applications of circRNA-next generation of RNA-based therapy ，Doi.org/10.1093/jmcb/mjad031
5.環狀RNA在病毒感染性疾病中的作用機制，DOI: 10.3760/cma.j.cn114452-20191225-00754
6.Translatomics: methods and applications，Doi: 10.1348/j.smhx.20170111
