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簡述circRNA療法的優勢與潛在挑戰
發布時間：2024.07.25
輝瑞/BioNTech和Moderna COVID-19 mRNA疫苗的成功推動了核酸藥物的崛起。目前 mRNA的應用方向主要涉及：針對傳染性疾病的預防性疫苗，針對腫瘤的治療性疫苗，蛋白替代療法，及基因編輯等。但是mRNA有很多缺點。首先mRNA必須經過修飾才能抵抗核酸酶降解并逃避先天免疫激活。第二mRNA的包裹有難度、價格昂貴，且修飾后的mRNA壽命依然不長，從而限制了治療性蛋白的產量影響治療效果。
幸運的是，在方興未艾的RNA藥物世界里，circRNA作為一種新型的、可傳遞遺傳信息的多功能治療介質，因其卓越的穩定性而有望成為mRNA有潛力的替代方案。根據2022年的一項調查，基于circRNA的療法已然一躍成為《自然-生物技術2021》的六個重要學術衍生產品之一，也是藥物研發公司的主要關注點之一。2022年，默克公司與Orna Therapeutics達成了價值高達35億美元的circRNA項目的合作（Orna Therapeutics公司是circRNA領域的先驅者）。
考慮到mRNA和circRNA在治療性蛋白表達中的作用機制相似，這使得將mRNA的治療應用擴展到circRNA成為可能。本篇將簡單介紹circRNA療法的潛在應用，并討論其作為治療介質使用的優勢與挑戰。
circRNA用于蛋白替代療法
蛋白替代療法的目的是恢復因基因突變所導致的缺失/缺陷的蛋白功能，將編碼功能性內源蛋白的mRNA遞送至靶細胞和組織，以恢復健康的表型。大多數無法治療的罕見疾病是基因功能缺失型，蛋白替代療法可以為這類疾病提供低風險的治療，如血友病、甲基丙二酸血癥、治療囊性纖維化等。
1.與mRNA相比，circRNA蛋白替代療法以下有幾個優勢。
更穩定
circRNA的結構賦予其更高的穩定性并更長的蛋白表達時間，因此與mRNA相比，circRNA的替代療法可以實現產量更高、更持久的蛋白表達水平。circRNA的替代療法可以更長時間地表達相關的治療蛋白，并有可能降低給藥頻率。
低免疫原性
mRNA有較高的免疫原性，可以通過病原體識別受體可以激活先天免疫系統，引發干擾素翻譯并抑制mRNA的治療作用；免疫刺激還可引發針對編碼產物不必要的免疫反應，從而抑制其功效。相比之下，由于缺乏末端的，未修飾的circRNA不易被病原體識別受體識別，具有較低的免疫原性。考慮到其較低的免疫原性和較高的再給藥潛力，這使得circRNA更適合于蛋白替代療法的應用。
2.circRNA蛋白替代療法也同樣面臨著挑戰
遞送系統的突破。脂質納米顆粒（LNP）是臨床上比較先進的包裹并遞送RNA到靶器官的載體。由于大多數LNP通過全身給藥后可定位于肝臟，因此大多數蛋白替代療法都局限于肝臟可表達的蛋白。研究人員也在考慮吸入給藥方式，但其給藥效率低于全身給藥。未來有必要創新LNP的配方和定向輸送，以擴大蛋白替代療法的在肝外組織的應用。
circRNA和mRNA蛋白表達缺乏微調機制。治療性蛋白的表達需要達到適當的功能水平，有效且不能超過毒性限度。內源蛋白的表達是通過基因水平的調控機制和反饋回路來精準控制的，但是對于外源性工程RNA來說，只有少數的小分子調控機制參與控制。進一步開發可控的工程化circRNA，實現精準調控蛋白表達，增加治療的療效與安全性。
免疫原性。盡管工程化circRNA的免疫原性低于mRNA，但circRNA仍然可以激活先天免疫系統。Chen等人(2017)首次表明，轉染工程化circRNA可刺激幾種免疫基因的表達，最顯著的是維甲酸誘導基因- i (RIG-I)。造成工程化circRNA免疫原性的原因可能有以下幾點：
circRNA生物發生的內含子，由內源性人ZKSCAN1內含子產生的circRNAs不具備免疫原性，但是利用T4噬菌體胸腺苷酸合成酶(td)基因的I型內含子則具備免疫原性（見圖1A）
m6A修飾促進了環化，降低了免疫原性（見圖1A）
circRNA制劑中少量線性RNA雜質可以引起強烈的細胞免疫反應
外顯子殘余物可以形成雙鏈二級結構，激活PKR（見圖1C）
圖一｜circRNA的免疫原性。(A) 工程化circRNA通過RIG-I誘導強烈的免疫反應，但m6A修飾的circRNA會消除免疫反應。(B)工程circRNA不具有免疫原性，但若純化不完全，含有5 '三磷酸的線性RNA雜志可以刺激細胞因子釋放。(C) 通過PIE自催化剪接包含在circRNA中的殘體可以通過PKR激活免疫反應。沒有殘余片段的circRNA會抑制PKR的激活。(doi/10.1093/jmcb/mjad002/7036773 )
circRNA在疫苗領域的應用
早在上個世紀 90 年代人們就提出了mRNA疫苗的概念。mRNA疫苗技術是將攜帶病毒抗原的遺傳信息（特定的病毒信息）的mRNA分子遞送至免疫細胞，免疫細胞表達相應的蛋白（病毒抗原）。這些蛋白分子可以誘導所需的適應性免疫反應，從而精準且迅速地為機體提供保護。mRNA疫苗免疫原性更強、無需佐劑、研發生產周期較短且生產工藝相對簡單，在面對易突變的病原體（如流感病毒），以及突發病毒（如新冠病毒、埃博拉病毒、寨卡病毒等）具有明顯優勢。但是mRNA疫苗的應用受其不穩定性、低效率和先天免疫原性的限制，而結合IRESs和ORF的circRNA疫苗則提供了一種改進的RNA疫苗方法，安全、穩定、且制造簡單性和可擴展性。
circRNAs疫苗具有多種優勢(見表1)。
circRNAs更穩定且易于儲存，無需修飾。mRNA疫苗表現出極端的不穩定性，因為它在運輸、儲存、遞送等過程中容易被RNA酶降解。盡管mRNA主鏈和UTR區域的核苷酸修飾使mRNA更穩定，但同時也使制造過程復雜化并增加了生產成本。由于疫苗的熱穩定性不佳，因此疫苗的儲存仍然需要低溫冷鏈。無需任何修飾的cirRNA表現出高穩定性和更好的抗Rnase水解的能力，可以在室溫或反復凍融條件下儲存。
未經修飾的circRNA副作用更少。mRNA疫苗引起的細胞毒性和副作用部分緣于其高免疫原性。與高免疫原性的修飾mRNA相比，未修飾的circRNA表現出較低的免疫原性和較低的細胞毒性。
circRNAs可以延長的蛋白持續表達的時間，這有助于抗原留在抗原呈遞細胞(APCs)中并延長抗原呈遞。這些因素促進了適應性免疫反應的有效觸發和中和抗體數量的增加。
表一｜mRNA疫苗與circRNA疫苗的比較
（doi.org/10.1038/s41392-023-01561-x）
circRNA疫苗和mRNA疫苗有許多相似之處，尤其重要的是，circRNA可以彌補mRNA疫苗的多重缺陷。盡管circRNA疫苗在設計、合成、純化、遞送和應用方面都處于早期階段，circRNA有望成為新一代基于RNA的疫苗平臺。
circRNA在腫瘤疫苗中的應用
mRNA 在癌癥疫苗中的應用非常廣泛，通過多種策略實現抑制腫瘤甚至清楚腫瘤的目的（見圖二）
抗原呈遞：mRNA 疫苗將癌癥抗原遞送至抗原呈遞細胞 (APC)，以呈遞主要組織相容性復合物 I 類和 II 類。
輔助功能：mRNA 通過與 APC 表達的模式識別受體結合來刺激免疫激活。
抗原受體：mRNA 將嵌合抗原受體 (CAR) 或 T 細胞受體等抗原受體引入淋巴細胞。
蛋白生產：mRNA 允許免疫調節蛋白的表達，包括 Toll 樣受體、趨化因子受體、共刺激配體、細胞因子、趨化因子和不同的單克隆抗體格式進入不同的細胞亞群。
圖二｜mRNA腫瘤疫苗的工作原理概述
（https://doi.org/10.1186/s12943-021-01348-0）
目前的mRNA腫瘤疫苗在免疫誘導等方面表現不佳，而circRNA先天優勢使其在腫瘤疫苗領域頗具前景。
circRNA的穩定性使得治療性蛋白穩定表達。與預防性病原體疫苗一樣，癌癥疫苗可以從延長抗原呈遞中獲益，從而產生更強的免疫反應。對于細胞治療，CAR的長期瞬時表達可以導致強的免疫反應，且安全。
應用circRNA可能會提高癌癥疫苗的免疫原性，使免疫刺激蛋白在癌癥免疫治療中可以更好地激活免疫系統。circRNA表達小擴散蛋白(如細胞因子和小抗體片段)的持續時間延長，可以更好地將免疫細胞招募到腫瘤部位。
可定制的circRNA可以實現適應個體癌癥，以進行精確的癌癥治療。多種抗原還可以在不同的circRNA上編碼，接種多種新抗原可以降低癌癥逃逸和復發的風險。
利用circRNA的穩定性，研究人員通過將表達CAR的circRNA引入T細胞，直接合成嵌合抗原受體(CAR) T細胞，簡化了T細胞分離再進行工程化生產CAR-T細胞的繁瑣過程。
circRNAs固有的低免疫原性是腫瘤內免疫激活蛋白表達的優勢。而未修飾的mRNA可激活先天免疫系統，降低抗體表達，阻止適應性免疫細胞對腫瘤的有效招募。
circRNA不依賴于cap的翻譯起始機制可以使其不受癌細胞狀態的影響，可靠地翻譯免疫激活蛋白（如細胞因子和抗體），即使對處在靜止狀態的癌癥干細胞亞群，circRNA也可保持穩健的翻譯。
用于基因編輯的circRNA
circRNA拓撲結構的穩定性使其在基因編輯領域大有可為。基因編輯系統中的gRNA與模板RNA環化后，都可獲得更大的穩定性和更好的編輯效率。circRNA也有望用于編碼基因編輯系統中的Cas9等。與mRNA相比， circRNA可更穩健地表達，使Cas9蛋白表達時間更持久性，蛋白表達量更高，相應地編輯效率也更高。
另一方面由于線性RNA的免疫原性可能干擾蛋白的產生并觸發清除編輯細胞的免疫反應，基因編輯需要無免疫原性的RNA。因此，免疫原性較低的circRNA有望成為基因編輯元件更為合適的介質。
但是，circRNA在基因編輯領域的應用還有很多挑戰。
基于RNA的基因編輯元件遞送到靶組織才能產生治療效果。目前遞送的載體主要有病毒載體與非病毒載體等。以AAV病毒載體為例（這是當下CGT領域最為先進的載體之一），其生產制造的挑戰、免疫原性以及載荷限制等問題都限制了這一載體應用。若選擇非病毒載體遞送mRNA和/或circRNA， 只能到達數目有限的幾種靶器官。因此尋找適合的遞送系統，擴大可應用的靶器官的范圍是未來circRNA以及mRNA的挑戰。
基因編輯療法，尤其是Crispr/Cas9 衍生的編輯技術，有脫靶的可能性。脫靶可能破壞細胞內的重要基因并有致癌風險。控制編輯蛋白表達的持續時間是降低脫靶率的可行策略之一。然而circRNA的穩定性延長了蛋白表達的時間，可能增加脫靶的幾率。目前還沒有研究調查mRNA與circRNA表達的Cas9的脫靶率。
由于環狀結構，circRNA capacity 有限。考慮到許多基因編輯蛋白都很大，如Cas9 大約4kb，而目前鮮有報告稱可以合成5kb或以上的circRNA。Cas9的大小可能超過circRNA容量，這使得有效環化具有挑戰性。為了克服這種尺寸限制，研究人員探索了各種策略。一種方法使用截短的Cas9版本， 另一種策略是將Cas9蛋白分成兩個或多個片段，單獨表達并在細胞中重新組裝成功能性的Cas9。
免疫原性是基因編輯療法的另一個問題。circRNA和Cas9都可以具有免疫原性，誘發免疫反應，移除編輯過的細胞。目前高達78%的人群已經對Cas9蛋白免疫，這進一步增加基因編輯療法的挑戰。盡管circRNA的免疫原性比較低，但還需要更多的研究來證明circRNA的低免疫原性能否足以避免編輯過程中的不良免疫反應。
Ref：
doi: 10.1038/s41467-018-05096-6
doi: 10.1038/s41587-022-01530-9.
doi.org/10.1016/j.addr.2023.114826
doi/10.1093/jmcb/mjad002/7036773
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doi.org/10.1038/s41392-023-01561-x
doi.org/10.1186/s12943-021-01348-0
doi: 10.13376/j.cbls/2021045
doi.org/10.1155/2016/1740936
doi: 10.1155/2018/1652567
doi.org/10.1016/j.omtn.2023.06.002
doi:10.3389/fgene.2022.823238
doi: 10.14218/MRP.2018.024
https://www.fiercebiotech.com/biotech/merck-bets-big-circular-rna-paying-150m-and-dangling-35b-biobucks-work-orna
