CDMO服務(wù)
GMP級生產(chǎn)制備平臺，先進(jìn)治療藥品走向世界和商業(yè)化的橋梁
腺相關(guān)病毒：基因治療商業(yè)化面臨的挑戰(zhàn)
發(fā)布時(shí)間：2024.08.23
自20世紀(jì)60年代以來，基因治療領(lǐng)域幾經(jīng)起落，現(xiàn)已成為繼小分子和抗體藥物之后的最受關(guān)注的生物科技領(lǐng)域之一。目前，基因療法主要采用病毒載體遞送系統(tǒng)，其中腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus, AAV)因其高效、安全、靶向性強(qiáng)等優(yōu)勢備受青睞，約三分之一的基因治療臨床試驗(yàn)選擇使用的是AAV載體。
隨著AAV生產(chǎn)工藝研發(fā)的不斷推進(jìn)，商業(yè)化的不斷加強(qiáng)、監(jiān)管的逐漸完善以及對該領(lǐng)域投資的日益增加，AAV基因治療領(lǐng)域取得了巨大的進(jìn)步。人們已經(jīng)將對其治療潛力的展望轉(zhuǎn)向了對這類療法商業(yè)化的期盼。截至發(fā)稿前，F(xiàn)DA業(yè)已批準(zhǔn)8款A(yù)AV基因療法上市（表1）。國內(nèi)AAV基因治療領(lǐng)域也在加速崛起，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，截至2024年3月已經(jīng)有近40款A(yù)AV基因治療藥物IND申報(bào)獲批，其中至少3款進(jìn)入III期臨床（包括紐福斯的NR082、信念醫(yī)藥的BBM-H901、諾華的OAV101）。中國的AAV基因療法也即將進(jìn)入商業(yè)化的時(shí)代。
表1：獲FDA批準(zhǔn)上市的8款A(yù)AV基因療法（宜明生物整理）
隨著AAV基因療法的不斷“破圈”，從罕見病領(lǐng)域到更多、更常見以及更復(fù)雜的適應(yīng)癥，意味著需要提供更高的產(chǎn)量以及更低的成本的病毒載體以滿足市場需求。但目前宿主細(xì)胞AAV生產(chǎn)率低，生產(chǎn)工藝放大壁壘高，以及生產(chǎn)過程中出現(xiàn)的高水平雜質(zhì)（如空殼率等）直接影響了基因治療藥物的商業(yè)化進(jìn)程。此外，AAV免疫原性和宿主免疫反應(yīng)、AAV藥物本身表征的難度、 各地區(qū)監(jiān)管機(jī)構(gòu)的差異等也阻礙了這些創(chuàng)新療法向臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化。本文將探討AAV在生產(chǎn)工藝等多個(gè)環(huán)節(jié)面臨的種種挑戰(zhàn)，以及可能的解決方案。
如何突破生產(chǎn)工藝的層層技術(shù)壁壘
病毒載體生產(chǎn)工藝改進(jìn)的最終目標(biāo)是實(shí)現(xiàn)上游更高的病毒滴度和下游更高的回收率以及更高效和可擴(kuò)展的制造平臺，從而提高病毒載體生產(chǎn)效率，降低產(chǎn)品成本，擺脫基因藥物“天價(jià)藥”的標(biāo)簽。
圖1：AAV的工業(yè)生產(chǎn)流程（圖片來自宜明生物）
上游生產(chǎn)環(huán)節(jié)的挑戰(zhàn)
在上游生產(chǎn)中，AAV生產(chǎn)細(xì)胞平臺的選擇是解決產(chǎn)量問題的關(guān)鍵。AAV生產(chǎn)平臺主要有三種：三質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)體系（Transient Transfection, TT）、桿狀病毒表達(dá)載體體系(Baculovirus expression vector， BEV)和穩(wěn)定包裝細(xì)胞系(Packaging/Producer cell line， PCL)。目前，絕大多數(shù)基于AAV的基因療法生產(chǎn)仍然使用三質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)體系。
表2：AAV幾大生產(chǎn)平臺優(yōu)勢與挑戰(zhàn)
1、在三質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)體系（TT）中，粘附培養(yǎng)方式(Adherent TT，aTT)盡管周期短，生產(chǎn)靈活，但是難以放大；而懸浮培養(yǎng)方式不僅具有可放大性，還可實(shí)現(xiàn)無血清培養(yǎng)，排除血清中未知組分以及外源因子的污染，更符合監(jiān)管要求，是AAV大規(guī)模生產(chǎn)主要采用的方式。
然而三質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)體系轉(zhuǎn)染過程復(fù)雜，除了受傳統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)工藝參數(shù)(如溫度、pH、攪拌速度)影響外，其他轉(zhuǎn)染工藝參數(shù)，如轉(zhuǎn)染試劑與DNA的比例、質(zhì)粒數(shù)量、質(zhì)量以及不同質(zhì)粒的比例、孵育時(shí)間、轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度等等都可能影響轉(zhuǎn)染效率與轉(zhuǎn)染后細(xì)胞健康情況。此外，哺乳動物細(xì)胞生產(chǎn)AAV能力有限可能導(dǎo)致其生產(chǎn)的病毒滴度低的根本原因。而AAV包裝效率低則是另一瓶頸，研究表明只有20%-30%的復(fù)制轉(zhuǎn)基因被衣殼包裝。因此，人們一直在尋求可替代TT的方法，以更有效和可擴(kuò)展的AAV生產(chǎn)方式。
在宜明生物，我們一直致力于通過技術(shù)創(chuàng)新來突破層層壁壘。
宜明生物Ubri-AdvancedTMGMP級AAV生產(chǎn)平臺是一個(gè)具成本效益和可擴(kuò)展性的病毒載體制造平臺，應(yīng)用三質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)體系，可實(shí)現(xiàn)50L-200L-500L-2000L規(guī)模生產(chǎn)。目前已經(jīng)成功完成四十余批次的GMP AAV生產(chǎn)，其中包括多批次500L大規(guī)模生產(chǎn)。截至目前共有五款宜明生物提供全程CDMO服務(wù)的AAV基因藥物IND申請快速獲批*
*：五款與宜明細(xì)胞合作獲批NMPA IND的AAV基因藥物分別是天澤云泰的“VGR-R01”和“VGB-R04 ”、朗昇生物的“LX101”、瑞吉康的“RJK002”、因諾惟康的“IVB103”
該平臺使用自主馴化的無血清懸浮293XSTM細(xì)胞株（已獲得國家知識產(chǎn)權(quán)局頒發(fā)的發(fā)明專利證書并完成FDA DMF備案），可以實(shí)現(xiàn)高密度培養(yǎng)，大幅度提高AAV產(chǎn)量。高產(chǎn)量可以減輕下游純化階段的壓力。另外通過對載體以及轉(zhuǎn)染體系的優(yōu)化，提高了AAV包裝效率，減少了空衣殼的產(chǎn)生，從而減輕了下游純化的負(fù)擔(dān)。
此外，質(zhì)粒是CGT藥物繞不開的起始物料，特別是對于采用“三質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)體系”生產(chǎn)的AAV載體。但質(zhì)粒工業(yè)化生產(chǎn)同樣面臨諸多挑戰(zhàn)：包括堿裂解、宿主RNA和染色體DNA的清除等問題。盡管大規(guī)模的生產(chǎn)可以降低成本，但目前GMP質(zhì)粒的價(jià)格仍高達(dá)每克數(shù)十萬美元。
宜明生物的Ubri-PerfectTM GMP 質(zhì)粒生產(chǎn)平臺可放大、高效且經(jīng)濟(jì)，可實(shí)現(xiàn)5L-10L-50L-200L規(guī)模生產(chǎn)。該工藝在大腸桿菌培養(yǎng)中具有較高的質(zhì)粒擴(kuò)增率，每升產(chǎn)量可達(dá)0.5～1克。專有的連續(xù)流堿性裂解工藝全程可控、高效的兩步色譜法極大地降低了成本。
BEV/Sf9系統(tǒng)與可以穩(wěn)定表達(dá)rep的Sf9細(xì)胞相結(jié)合，可用于靈活的、高滴度的大規(guī)模AAV載體生產(chǎn)。該生產(chǎn)體系安全性好, 感染效率高, 生產(chǎn)工藝較之sTT更易放大，生產(chǎn)率更高。但是有報(bào)道稱BEV體系生產(chǎn)的AAV因發(fā)生衣殼蛋白翻譯后修飾而降低傳染性，因此哺乳動物生產(chǎn)細(xì)胞系統(tǒng)仍然是病毒載體生產(chǎn)的更可靠的選擇。
穩(wěn)轉(zhuǎn)包裝細(xì)胞系穩(wěn)定持續(xù)表達(dá)輔助基因rep/cap以及目的基因等載體成分，這項(xiàng)技術(shù)無需質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，只需經(jīng)腺病毒感染后（wtAd5）即可包裝出AAV病毒，可直接放大生產(chǎn)規(guī)模。但是, 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系構(gòu)建周期長， 且與BEV/Sf9系統(tǒng)一樣，在生產(chǎn)過程中需要使用輔助病毒感染，不僅給下游純化帶來負(fù)擔(dān)，也增加了安全隱患。
綜上所述，上游的幾大生產(chǎn)系統(tǒng)都有各自的優(yōu)勢和挑戰(zhàn)，選擇“最佳”生產(chǎn)平臺其實(shí)是在靈活性、可擴(kuò)展性和質(zhì)量之間的權(quán)衡，這三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)對于快速開發(fā)和商業(yè)化安全有效的產(chǎn)品都很重要。開發(fā)者要評估總體產(chǎn)品需求、臨床試驗(yàn)時(shí)間表、目標(biāo)患者群規(guī)模，然后再結(jié)合各個(gè)平臺的風(fēng)險(xiǎn)做出明智的選擇。另外關(guān)于各大平臺工藝的參數(shù)對AAV安全性和有效性的影響尚未完全知曉，因此需要在早期明確選擇，以規(guī)避切換生產(chǎn)平臺所導(dǎo)致的各種阻礙。
圖2:病毒載體三大生產(chǎn)體系靈活性、可擴(kuò)展性和質(zhì)量之間的比較
（圖片源自https://www.mckinsey.com/industries/life-sciences/our-insights/viral-vector-therapies-at-scale-todays-challenges-and-future-opportunities）
下游生產(chǎn)環(huán)節(jié)的挑戰(zhàn)
AAV下游加工的目的是從上游產(chǎn)物中分離并純化AAV載體，使最終產(chǎn)品達(dá)到需要的純度。不同上游生產(chǎn)平臺產(chǎn)生的雜質(zhì)相似，包括工藝相關(guān)雜質(zhì)，如宿主相關(guān)的蛋白、DNA以及殘留的輔助病毒等；產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)，如空衣殼。由于AAV病毒載體純化的復(fù)雜性，目前尚未建立業(yè)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)化的下游純化流程。
下游工藝的成敗往往受到上游生產(chǎn)的影響，理想的起始原料（高滴度、高活性、低空殼率的AAV）對于下游生產(chǎn)至關(guān)重要。但AAV載體上游產(chǎn)量普遍較低，增加了下游捕獲和純化的難度。另外的一個(gè)難點(diǎn)是較高雜質(zhì)水平。其中空衣殼是目前業(yè)內(nèi)最為關(guān)注的雜質(zhì)之一。
在AAV載體組裝過程中，除了正確包裝的DNA序列的完整衣殼（full capsid），還會出現(xiàn)部分衣殼（partial capsid），和空衣殼（empty capsid）。后兩者屬于雜質(zhì)，不僅僅影響產(chǎn)品的純度，增加最終產(chǎn)品的免疫原性，還會與完整衣殼競爭結(jié)合受體，從而抑制完整衣殼的轉(zhuǎn)導(dǎo)，增加總體病毒載量。部分衣殼與空衣殼的存在嚴(yán)重地影響了AAV產(chǎn)品的安全性和有效性，因此監(jiān)管機(jī)構(gòu)強(qiáng)烈建議在整個(gè)生產(chǎn)過程中監(jiān)控空/完整衣殼比（空殼率）。
氯化銫(CsCl)/碘克沙醇密度梯度離心是最傳統(tǒng)的AAV純化技術(shù)方法，但因難以放大和低通量等劣勢逐漸被色譜法取代。色譜法通過載體的凈電荷、疏水性、對配體的親和性、大小以及其他性質(zhì)來分離并純化載體。這類技術(shù)更具可擴(kuò)展性和成本效益，可并聯(lián)或串聯(lián)運(yùn)行，還可有效去除非定植劑。其中親和層析（Affinity chromatography，AC）是目前首選的病毒捕獲步驟，離子層析（Ion-exchange chromatography，IEC）可以有效的分離空衣殼。
圖3：AAV的捕獲（親和層析AAV的純化），通過AAV與填料的基質(zhì)上偶聯(lián)的抗體或納米體地特異性結(jié)合來實(shí)現(xiàn)
（源自：https://doi.org/10.1016/j.omtm.2020.10.001)
然而，目前只有一小部分親和樹脂可以與一種或幾種AAV病毒血清型特異性結(jié)合，如AVB Sepharose可選擇性結(jié)合AAV 1、2、3和5以及POROSTM CaptureSelect 可選擇性結(jié)合AAV8、AAV9和AAVX（包括血清型1-9和工程化衣殼）。而且配體設(shè)計(jì)和制造的高成本也一定程度限制了親和層析在大規(guī)模病毒生產(chǎn)過程中的應(yīng)用。因此為了能開發(fā)出更經(jīng)濟(jì)、高效的捕獲和純化AAV的新方法 ，還要更深入地了解病毒載體與不同吸附表面（親和層析、多模式色譜和離子交換色譜材料）的結(jié)合。
離子交換層析是一種通用、經(jīng)濟(jì)且高效的大規(guī)模AAV純化技術(shù)，利用病毒顆粒表面電荷差異化去除空衣殼（空衣殼PI～6.3，完整衣殼PI～5.9）。離子層析的高分辨率需要復(fù)雜的梯度，但穩(wěn)健的梯度洗脫仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)。為了充分分離所有血清型的載體，人們?nèi)匀辉谔剿餍滦蜆渲c方法。比如CIMmultusTM PrimaT是一種分離空衣殼的離子交換-氫鍵多模式色譜柱，為空衣殼和滿衣殼的分離提供了一種新的正交選擇，其功能等同于離子交換柱，但通常分辨率更高。
在宜明生物，得益于上游293XSTM細(xì)胞株的高產(chǎn)量，以及優(yōu)化轉(zhuǎn)染體系后的高包裝效率，疊加對色譜技術(shù)的不斷開發(fā)，下游純化平臺實(shí)現(xiàn)了更高的可擴(kuò)展性和產(chǎn)品一致性。另外，該平臺無血清、無動物源性生產(chǎn)原料、無抗生素、無輔助病毒等，減少了外源性雜質(zhì)的引入，也緩解了下游純化的壓力。可擴(kuò)展的兩步法純化流程，可用于多種血清型的純化，包括rAAV2/2、rAAV2/5、rAAV2/8、rAAV2/9，在兩步法純化后實(shí)心率近90%。
與監(jiān)管機(jī)構(gòu)的溝通
世界各地的監(jiān)管機(jī)構(gòu)都已經(jīng)認(rèn)識到AAV療法的潛力，并致力于為其開發(fā)和批準(zhǔn)建立更清晰的指導(dǎo)方針。由于AAV基因治療領(lǐng)域是新興領(lǐng)域，在大規(guī)模生產(chǎn)以及商業(yè)化方面經(jīng)驗(yàn)有限，在不同地區(qū)監(jiān)管要求也可能存在差異。這些差異可能涉及到技術(shù)適應(yīng)性測試、合規(guī)審查、申請程序等。除了要滿足不同地區(qū)監(jiān)管的要求和規(guī)定，開發(fā)者在新藥多地申報(bào)時(shí)（中、美、歐等），還可能面臨語言障礙、文化差異、專業(yè)知識等挑戰(zhàn)。
宜明生物作為一家CDMO服務(wù)商，我們以客戶需求為中心，在不斷進(jìn)行底層技術(shù)創(chuàng)新的同時(shí)，也為客戶在中、美等多地申報(bào)提供服務(wù)，為新藥的商業(yè)化節(jié)省資金與時(shí)間成本。
用于AAV生產(chǎn)的現(xiàn)貨輔助質(zhì)粒系統(tǒng)（DMF 28890）以及無血清懸浮293XS細(xì)胞庫（DMF 28844）均已完成FDA DMF備案，極大地縮短產(chǎn)品在FDA審查和評估時(shí)間。
在中美兩地設(shè)有申報(bào)團(tuán)隊(duì)，一站式助力客戶完成中美雙報(bào)項(xiàng)目，目前已有數(shù)十例注冊申報(bào)成功案例。
小結(jié)
盡管商業(yè)化道路曲折坎坷，但基因療法是仍然是全球生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)競爭最重要的“新賽道”之一，AAV依舊是一種非常具有吸引力的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)方式。隨著底層技術(shù)不斷創(chuàng)新升級，資本的持續(xù)青睞，國家與各地政府的有力扶持，層層技術(shù)壁壘的打破，病毒載體可實(shí)現(xiàn)更好的成本控制，提高AAV藥物的可及性，充分發(fā)揮發(fā)揮CGT的更大潛力，惠及更多的患者。
Ref：
https://doi.org/10.1002/bit.28412
https://doi.org/10.1016/j.coche.2021.100780
https://doi.org/10.1016/j.chroma.2023.464337
https://doi.org/10.1016/j.omtm.2020.10.001
https://www.mckinsey.com/industries/life-sciences/our-insights/viral-vector-therapies-at-scale-todays-challenges-and-future-opportunities
